目前主流的实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术主要分为染料法和探针法。其中，染料法以SYBR Green法为代表，该方法中，SYBR Green染料在游离状态下荧光微弱，但与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。反应管中的荧光强度与双链DNA的数量呈正比关系，因此，通过测量荧光强度，可以推算出反应管中产生的双链DNA（PCR产物）的量。然而，该方法缺乏特异性，可能会将非特异性扩增的产物计入其中。

与染料法不同，探针法同样依赖反应管中的荧光强度来判断PCR产物的数量，但其发光机制截然不同。荧光是光致发光的现象，某种物质在特定波长的光照射下，吸收光能并跃迁至激发态，随后以高于入射光波长的光形式释放能量。这一原理使得荧光在广泛的生物医疗应用中变得尤为重要。

荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是探针法qPCR的核心原理。当一个荧光供体与受体之间的距离处于1-10纳米时，供体激发后不会发出光，而将能量转移给受体。如果受体荧光量子产率为零，则会导致供体的荧光熄灭；如果受体发光且具备荧光特性，则会发出光并导致荧光光谱的红移。

目前，所有探针法qPCR的理论基础都基于这一能量转移现象。探针上存在能够产生FRET的两个基团，利用PCR过程中的一些操作（如酶切和杂交）改变二者的距离，从而影响系统的荧光强度或种类。这种变化与PCR产物的类型和数量直接相关，通过监测这些变化，可以准确检测PCR反应体系中产物的种类及其数量。

几种主要的qPCR探针法

1. Taq-Man探针：Taq-Man探针法是经典的探针方法，通过设计与扩增产物互补的探针，在其5’端标记荧光供体，3’端标记淬灭剂。探针完整时，荧光团与淬灭团距离很近，因而不发出光。当PCR进行时，探针结合于扩增产物上，当引物介导的延伸到达探针时，因Taq酶的5’-3’外切酶活性会切割探针，使荧光团和淬灭剂分离，荧光团在合适的激发下便能发光。这一特异性的探针法因而能够准确反映目标产物的种类和数量。

2. 双杂交探针：与Taq-Man法不同，双杂交探针的供体和受体分别存在于两条探针上。这两条探针能够相互结合在扩增产物上，保持在10纳米以内的距离，从而实现FRET现象，能够有效确认扩增产物的状态。

3. 分子信标探针：该探针以改变荧光团和淬灭团的距离为原理。在与靶序列结合前，信标探针呈现茎环结构，合成结构时荧光团与淬灭团紧靠在一起，不发光。扩增生成的靶序列后，探针发生构象变化，荧光团得以发光。

4. 蝎形探针：此探针通过设计在3’端附带PCR引物，在分子内部就能实现杂交，避免了两个分子的参与，大大提高了反应的速度与效率。这些探针策略在生物医学领域具有广泛的应用前景。

在生物医疗研究中，实时荧光定量PCR技术持续发挥着重要作用，品牌尊龙凯时人生就博亦致力于推动该领域的发展，为科学研究和临床应用提供更精准的解决方案。